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Pruebas de laboratorio para el diagnóstico de la Bronquitis Infecciosa (BI)

• Aislamiento viral
• Serología
  • Prueba de precipitación en agar gel (PAG)
  • Prueba de virus neutralización (VN)
  • Prueba de Inhibición de la Hemoaglutinación (IHA)
  • Prueba de Inmuno Ensayo Enzimático (ELISA = del inglés "Enzyme linked Immuno Sorbent Assay")

Aislamiento viral - Identificación del antígeno

• El aislamiento viral se lleva a cabo usualmente en huevos embrionados de 9-10 días libres de patógenos específicos (SPF). Puede ser necesaria una serie de pases en ciego antes de que los signos clínicos característicos de la presencia del VBI sean observados en los embriones. Las lesiones típicas en los embriones como encurvamiento y enanismo, embolillamiento del plumón, así como embriones enrojecidos o hemorrágicos y la posibilidad de encontrar depósitos de uratos en lo riñones pueden aparecer a los 5-7 días post inoculación. También es posible utilizar cultivos de anillos traqueales para el aislamiento del virus de la BI. En este caso, se ven ciliostásis y daños al epitelio traqueal a las 48 - 72 horas luego de la inoculación, observándose los anillos traqueales con un microscopio en aumento bajo. Este método da resultados más rápidos que cuando se utilizan huevos embrionados, pero se tiene que confirmar la identidad del virus de la BI por otros métodos ya que no es éste el único que puede causar ciliostásis del epitelio de la tráquea. La prueba de ciliostasis.
• Prueba de inmunofluorescencia con conjugado de anticuerpos y fluoresceína, el cual se adhiere al VBI en los preparados traqueales en caso de que el virus se encuentre presente.

Comparación de un embrión normal de 18 días (derecha) con dos embriones infectados de la misma edad, los cuales muestran enanismo

Aislamiento viral - detección del genoma

• Se utiliza el RT-PCR (del inglés: real time polymerase chain reaction = análisis del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción) con “primers” específicos para la detección del genoma del virus en pruebas de tráquea o en huevos embrionados inoculados o en cultivo de órganos de tráquea.
• RFLP (del inglés: restrictive fragment length polymerase = reacción de la polimerasa restrictiva de la extensión del fragmento), reconoce el genoma del VBI y se utiliza para determinar el genotipo.
• Tipificación del VBI por la secuencia de los ácidos nucleicos
• Tipificación del VBI por el RT-PCR de tiempo real

Ver Aislamiento viral - detección del genoma

El análisis de muestras de sueros a intervalos determinados (por ejemplo en el momento de la presencia de los signos clínicos y 2-3 semanas después) es la base para el diagnóstico serológico. Esto también se aplica para el chequeo de los resultados de la vacunación.

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Serología

Prueba de Precipitación en Agar Gel (PAG)

Poco después de la infección ocurrirá un aumento de anticuerpos precipitantes, los cuales se reducirán posteriormente. La prueba no es específica para el serotipo pero puede ser útil para la determinación de una infección reciente. Tiene la ventaja de ser una prueba rápida y fácil de hacer. Para la prueba se hacen dos orificios en una placa de agar gel y en los mismos se coloca de un lado el antígeno conocido de BI y del otro el suero sospechoso, los cuales migran por el gel. Habiendo una interacción entre el antígeno y los anticuerpos específicos para BI en el gel habrá precipitación del antígeno lo que resulta en una línea visible identificable en el gel.

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Prueba de Virus neutralización (VN)

La prueba de virus neutralización (VN) es el método más preciso para la diferenciación entre serotipos del VBI así como para la identificación de la identidad de serotipos nuevos. Para llevar a cabo la prueba es necesario tener un cultivo de cada virus de interés así como el antisuero monoespecífico para cada uno de ellos. Estos antisueros son muy importantes si se desea hacer una diferenciación precisa entre los diferentes serotipos. Cada uno se prepara inoculando intranasalmente a aves libres de patógenos específicos con uno de los serotipos del VBI de interés. Se obtiene la sangre de los pollos 3-4 semanas después y el suero obtenido contiene anticuerpos específicos para el VBI inoculado.

En un sistema de laboratorio, como sería los huevos embrionados de pollo o cultivo de órganos de tráqueas, cada virus de interés se prueba contra el antisuero específico producido contra cada uno de ellos. Esto puede ser hecho de dos maneras; analizando una dilución de cada antisuero contra una serie de diluciones del virus, o (lo que es más preciso) analizando una cantidad conocida de cada virus contra una serie de diluciones del antisuero. De esta manera, como se demuestra a continuación, es posible producir una tabla mostrando el título de cada VBI contra el suero para el serotipo homólogo (el mismo) así como para los serotipos heterólogos. Cuanto mayor sea el título, mayor será la relación entre los virus. De esta manera es por tanto posible decir si un aislado de campo es una “nueva” variante o si se relaciona con uno de los serotipos conocidos.

^a Título homólogo en negrito
^b Título </= 1:20
^c No hecho

(Cook et al, 1999)

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Prueba de Inhibición de la hemoaglutinación (IHA)

El VBI no aglutina espontáneamente los glóbulos rojos de gallinas; para eso necesita ser tratado con la enzima neuraminidasa.

La prueba es una alternativa posible a la prueba de VN ya que es mucho más simple y rápida. La prueba de IHA puede ser serotipo específica si es llevada a cabo por personas con experiencia bajo condiciones de laboratorio rígidamente controladas. Esto es debido a que cuando las aves son expuestas a más de un serotipo diferente del VBI habrá un nivel más elevado de reactividad cruzada entre los serotipos que en la prueba de VN.

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Prueba de Inmuno Ensayo Enzimático (ELISA = del inglés "Enzyme linked Immuno Sorbent Assay")

Anticuerpos específicos en el suero se unen al virus, el cual está adherido al fondo del una placa de 96 pocillos. El complejo es detectado por una anti- γ -globulina marcada con una enzima. Después de la adicción de un substrato para la enzima se puede medir la reacción por la producción de un cambio de color. La prueba no es serotipo específica pero puede ser una herramienta importante para controlar una respuesta adecuada de anticuerpos en el lote, por ejemplo tras una vacunación. Existe una serie de marcas comerciales de esta prueba disponibles en el mercado.

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