Aislamiento viral - detección del genoma

Los diferentes tipos del virus de la BI se pueden identificar por medio de la secuenciación de sus glucoproteinas o ácidos nucleicos o por medio del PCR en tiempo real.

Tipificación del virus de la Bronquitis Infecciosa (VBI) por medio del RT-PCR y RFLP

La secuencia de la proteína de la espícula del VBI es única y por tanto puede ser usada para identificar los diferentes tipos del virus. Primero se utiliza el RT-PCR para amplificar el gen de la espícula y luego enzimas restrictivas que funcionan como tijeras moleculares, las cuales cortan el producto amplificándolo en porciones de longitud única llamados fragmentos de restricción. Cuando se visualizan en un gel de agarosa, los fragmentos de restricción  forman un patrón que puede ser usado para identificar los diferentes tipos de VBI en la muestra. Esta técnica puede identificar todos los serotipos conocidos del virus y sus variantes. Además permite reconocer la presencia de más de un tipo del virus en la muestra.

Tipificación del virus de la Bronquitis Infecciosa (VBI) por medio del RT-PCR y RFLP

Tipificación del virus de la Bronquitis Infecciosa (VBI)
por medio del RT-PCR y RFLP

 

RFLP del gen S1 del VBI amplificado en el RT-PCR

RFLP

Tipificación del VBI por la secuencia de los ácidos nucleicos

La tipificación del VBI también es posible por medio de la secuencia del ácido nucleico. Típicamente se amplifican en el RT-PCR las regiones hipervariables del gen de la glucoproteína de la espícula, las cuales son zonas de secuencias muy variables que correlacionan con el tipo de VBI. El producto amplificado puede ser directamente secuenciado para determinar el tipo de VBI en la muestra. Además, la secuencia puede ser utilizada para buscar en GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/), que es un banco de datos de secuencias de ácidos nucleicos provenientes de todo el mundo. El análisis filogenético que se conduce con los virus en la base de datos permite establecer la relación entre los virus.

chromatogram

Tipificación del VBI por el RT-PCR de tiempo real

El RT-PCR de tiempo real es la reacción de RT-PCR que incluye un tinte fluorescente o prueba etiquetada que se utiliza para la detección del ADN amplificado a medida que se va produciendo. La ventaja del RT-PCR de tiempo real es que puede ser hecho en cuestión de minutos y es cuantitativo. Se han desarrollado pruebas de RT-PCR de tiempo real específicas para el VBI (Callison et al. J. Virol. Methods 138:60-65, 2006).

La fluorescencia se monitora durante la amplificación del PCR

Ct = umbral del ciclo o número del ciclo en que la cantidad de fluorescencia indica que la muestra es positiva. Cuanto menor el valor del Ct, mayor la cantidad de virus en la muestra.